新一代高內(nèi)涵分析細(xì)胞成像系統(tǒng) ─ IN Cell Analyzer 2000在4月底法國(guó)里爾的生物分子科學(xué)學(xué)會(huì) (SBS)第15屆年會(huì)上首度亮相?，F(xiàn)場(chǎng)的系統(tǒng)演示贏得了眾多參訪者的肯定及熱烈回響。該系統(tǒng)的靈活性讓研究人員用單個(gè)儀器就能完成過去具挑戰(zhàn)性的實(shí)驗(yàn)：從顯微觀察到自動(dòng)化篩選，以及細(xì)胞器、細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體的成像。本文特為您展示全新的IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)如何成為您的得力科研助手。
IN Cell Analyzer 2000有著硬件和軟件的獨(dú)特組合，能夠非常快速地獲取圖像，是篩選的理想選擇。該儀器是利用六西格瑪原理來(lái)設(shè)計(jì)的，結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，能確保它在多用戶環(huán)境中高通量應(yīng)用的可靠性。
利用IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)分析干細(xì)胞克隆
沿襲 IN Cell Analyzer 1000高質(zhì)量成象，功能完整性及模塊化設(shè)計(jì), IN Cell Analyzer 2000新增一些新特征包括：
● 全新硬件設(shè)計(jì): 更穩(wěn)定,易操作和一體化主機(jī), 將CO2, 溫控, 液體操控和電源/穩(wěn)壓全部集為一體
● 更快的聚焦和成像掃描速度: 比IN Cell Analyzer 1000提高約一倍
● 增加予掃描功能: 在獲取圖像之前對(duì)樣品的選定區(qū)域進(jìn)行快速的預(yù)覽掃描, 使用者可以快速找尋到關(guān)鍵位點(diǎn)并獲取圖像,大幅提升對(duì)于干細(xì)胞、神經(jīng)突生長(zhǎng)等非融合性細(xì)胞觀測(cè)的準(zhǔn)確度及效能
● 高性能大視野CCD和全孔成像：照相機(jī)加上寬視野光源，確保一次完成整孔的成像而無(wú)需多次成像后的拼接,在單張圖像中捕獲整個(gè)細(xì)胞孔的信息，提高成像能力
● 更寬范圍高NA值物鏡選擇(2×, 4×, 10×, 20×, 40×, 60×, 100×): 滿足多種靈敏度和放大倍數(shù)的要求
● 全自動(dòng)物鏡, 分光器和濾光片切換選擇
● 更高圖像分辨率和質(zhì)量: 提供多種圖像分析處理方式 (2D, 2.5D, 3D deconvolution?)
● 三種透視光(白光)成像功能: 亮視野, DIC, 像差
導(dǎo)語(yǔ)
下文的數(shù)據(jù)將顯示全新的IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)的特征如何克服這些困難：(1) 大芯片照相機(jī)能在2倍物鏡下實(shí)現(xiàn)高通量單圖像全孔捕獲，而圖像陰影小，同時(shí)又有足夠的圖像分辨率來(lái)區(qū)分單個(gè)細(xì)胞;(2) 對(duì)于高放大率成像，用戶控制的命令能移動(dòng)/改變目的克隆的物鏡，而無(wú)縫圖像拼接實(shí)現(xiàn)了高分辨率的全孔成像。
IN Cell Investigator軟件能實(shí)現(xiàn)克隆與滋養(yǎng)層細(xì)胞的同時(shí)分析。此軟件還能自動(dòng)拼接圖像，測(cè)量克隆數(shù)目、大小、形狀，確定細(xì)胞數(shù)量，并定量克隆的表型標(biāo)志物。
方法
包含未分化干細(xì)胞克隆和滋養(yǎng)層細(xì)胞的預(yù)染色固定樣品的96孔板是由加利福尼亞大學(xué)干細(xì)胞研究中心的Peter Donovan教授饋贈(zèng)的。所有的細(xì)胞核用Hoechst染色，多能細(xì)胞通過Oct4的熒光抗體檢測(cè)來(lái)分析，有絲分裂細(xì)胞則利用磷酸組蛋白H3的Texas Red結(jié)合抗體來(lái)檢測(cè)。培養(yǎng)條件及處理的詳細(xì)方法可參照加利福尼亞大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的近期論文。4,5
圖像獲取
圖像是利用2倍物鏡(0.1NA)、透射光和熒光模式及適當(dāng)?shù)臑V光片和曝光時(shí)間在IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)上獲得的。大的照相機(jī)尺寸再加上2倍物鏡，能獲得每邊7.6 mm的視場(chǎng)，在單次圖像捕獲時(shí)覆蓋96孔板的全孔區(qū)域(直徑6.5 mm)。圖像還利用4倍物鏡(0.1 數(shù)值孔徑)獲得，此時(shí)全孔捕獲就需要4個(gè)像場(chǎng)。4倍物鏡圖像有5%的重疊，以便能利用IN Cell Investigator(Developer工具箱)軟件進(jìn)行圖像拼接。
圖1. 96孔板單孔中的干細(xì)胞克隆和滋養(yǎng)層細(xì)胞在2倍物鏡下的熒光全孔圖像。細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色后所獲得的圖像，它標(biāo)出了干細(xì)胞克隆和滋養(yǎng)層細(xì)胞中的所有細(xì)胞核(A)。多能干細(xì)胞則利用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)Oct4表達(dá)來(lái)鑒定(B)。
圖1顯示了干細(xì)胞克隆和滋養(yǎng)層細(xì)胞所獲得的典型圖像。此類圖像的定量分析策略概括在圖2中。
圖2. 干細(xì)胞克隆和滋養(yǎng)層細(xì)胞的圖像分析。所有的細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染色(A)，并利用IN Cell Investigator(Developer工具箱)的自動(dòng)化圖像分析來(lái)檢測(cè)(B)。借助用戶定義的對(duì)象擴(kuò)大、孔填充和大小過濾等后處理工具，這些克隆作為單獨(dú)的目標(biāo)組從所有細(xì)胞核中區(qū)分開來(lái)(C)。隨后使用目標(biāo)連接(target-linking)來(lái)確定與克隆有重疊的細(xì)胞核(D)。一旦所有的目標(biāo)都被指定，軟件會(huì)自動(dòng)計(jì)算這些對(duì)象的數(shù)目、形態(tài)描述符以及熒光密度相關(guān)的測(cè)定。
圖3顯示了克隆中稀有事件的分析，如有絲分裂細(xì)胞的數(shù)量。
圖3. 干細(xì)胞克隆中稀有事件的逐個(gè)細(xì)胞分析。一旦利用IN Cell Investigator鑒定出干細(xì)胞克隆(A, B)，就能確定Oct4表達(dá)(C)和磷酸組蛋白H3(D)陽(yáng)性的克隆特異細(xì)胞核的數(shù)量。軟件自動(dòng)計(jì)算出表達(dá)這些標(biāo)志物的克隆特異細(xì)胞核的比例(E)。
表1. 圖3E中3個(gè)高亮克隆的干細(xì)胞克隆分析的典型數(shù)據(jù)。
2倍物鏡所提供的分辨率已足以進(jìn)行全孔圖像的逐個(gè)細(xì)胞分析，單個(gè)克隆的匯總數(shù)據(jù)如表1所示。我們已經(jīng)將全孔2倍圖像的分析數(shù)據(jù)與4倍物鏡下圖像的對(duì)應(yīng)結(jié)果進(jìn)行了比較，在4倍物鏡下每孔需要4個(gè)視場(chǎng)來(lái)完整覆蓋。
圖4. 2倍與4倍圖像的分析數(shù)據(jù)比較。利用4個(gè)像場(chǎng)對(duì)4倍物鏡下所獲得的全孔圖像進(jìn)行了圖像拼接(A)。對(duì)2倍圖像(B)及對(duì)應(yīng)4倍拼接圖像中的10個(gè)隨機(jī)選擇克隆進(jìn)行了分析。柱形圖顯示了2倍或4倍分析中克隆面積和每個(gè)克隆的總細(xì)胞核計(jì)數(shù)的比較數(shù)據(jù)。
圖4的結(jié)果顯示2倍物鏡下所獲得的全孔圖像分析數(shù)據(jù)不亞于4倍物鏡下相同孔所獲得的相似分析數(shù)據(jù)。我們還研究了干細(xì)胞樣品板的明場(chǎng)成像及分析。初步結(jié)果顯示，利用Developer的**圖像預(yù)處理功能，克隆計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)分析都是可行的。
圖5. 4倍物鏡下所獲得的明場(chǎng)拼接圖像與熒光下所獲得的全孔2倍圖像的比較。利用Developer軟件的圖像拼接，顯示了利用4個(gè)像場(chǎng)在明場(chǎng)的4倍物鏡下所獲得的全孔圖像(A)。對(duì)2倍全孔熒光圖像(B)及相同孔的4倍物鏡明場(chǎng)拼接圖像(C)中的10個(gè)隨機(jī)選擇克隆進(jìn)行了分析。柱形圖顯示了2倍熒光或4倍明場(chǎng)分析中克隆面積的比較數(shù)據(jù)。
小結(jié)
?IN Cell Analyzer 2000能利用熒光和透射光模式，進(jìn)行干細(xì)胞的自動(dòng)成像。
?系統(tǒng)的大照相機(jī)在2倍物鏡下能捕獲7.6×7.6 mm2的視場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)快速的96孔板單圖像全孔捕獲。
結(jié)論
?2倍物鏡的分辨率對(duì)于干細(xì)胞克隆的單細(xì)胞分析已經(jīng)足夠，其數(shù)據(jù)與利用4倍物鏡所獲得的數(shù)據(jù)相當(dāng)。
?更高分辨率的全孔成像可以通過系統(tǒng)的視場(chǎng)重疊功能及IN Cell Investigator的自動(dòng)圖像拼接來(lái)實(shí)現(xiàn)
人們普遍預(yù)測(cè)干細(xì)胞研究將會(huì)對(duì)多種人類**的了解及終**產(chǎn)生重大影響。
1 干細(xì)胞的特征是具有分化成多種細(xì)胞表型的能力(多能性)，但培養(yǎng)時(shí)分化的程度完全取決于細(xì)胞生長(zhǎng)條件，而培養(yǎng)物多能性的維持常常離不開滋養(yǎng)層細(xì)胞。這些細(xì)胞的特征之一是當(dāng)它們處于未分化狀態(tài)時(shí)，一般以緊密擠壓的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。利用自動(dòng)化熒光顯微鏡進(jìn)行的高內(nèi)涵分析能夠在單細(xì)胞水平產(chǎn)生信息量豐富的數(shù)據(jù)，非常適合干細(xì)胞培養(yǎng)和分化研究。
2 多能性通常是通過特定標(biāo)志物如Oct-4的抗體檢測(cè)來(lái)監(jiān)控的，而分化的程度則通過不同細(xì)胞譜系的特定標(biāo)志物的外觀來(lái)測(cè)量。對(duì)于這些分析的自動(dòng)化成像，挑戰(zhàn)在于在常規(guī)的96孔板形式中，干細(xì)胞克隆的位置并沒有預(yù)先確定。這就需要獲取每個(gè)孔的多個(gè)視場(chǎng)，來(lái)確保全部區(qū)域都被覆蓋。這一點(diǎn)很實(shí)際，特別是當(dāng)相對(duì)稀有的事件被檢測(cè)到，如干細(xì)胞克隆中的部分細(xì)胞在特定的時(shí)間點(diǎn)活躍地發(fā)生著有絲分裂。當(dāng)需要多張圖像來(lái)捕獲全孔時(shí)，克隆有時(shí)候很大，重疊了圖像邊界，這樣就很難準(zhǔn)確判斷克隆數(shù)量和形態(tài)。(生物幫bio1000.com)
1 Robert Graves*, 1 Zahra Masoumi & 2 Alla Zaltsman
1美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán);2英國(guó)英格蘭白金漢郡安瑪西亞鎮(zhèn)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)
e-mail: Robert.Graves@ge.com。
