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從土壤等復(fù)雜樣品中提取DNA
在植物賴以生存的土壤中，生活著大量的微生物，包括**、**、放線菌、病毒和原生生物等。據(jù)估計(jì)，1 g土壤中有4,000～7,000種**，數(shù)量近10億個(gè)。然而，由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性，常規(guī)的培養(yǎng)法、生物量測(cè)量法都對(duì)這些微生物束手無(wú)策。這時(shí)，分子生物學(xué)技術(shù)就成為研究土壤宏基因組的新式武器。
盡管我們派出了新式武器，但土壤畢竟不同于實(shí)驗(yàn)室的**培養(yǎng)液，土壤本身的異質(zhì)性、微生物的多樣性及其對(duì)土壤顆粒的黏附都使得DNA的提取比較困難。此外，樣品中常常存在腐植酸類物質(zhì)，它們可能抑制下游反應(yīng)中的DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶的活性，降低轉(zhuǎn)化效率，須盡量除去。因此，一般的dna提取試劑盒是無(wú)法勝任的，專門的土壤DNA提取試劑盒才更給力。
美國(guó)MO BIO公司專門研究復(fù)雜樣本的核酸純化，針對(duì)土壤樣品、水樣及生物膜，推出了一系列DNA提取試劑盒。有了這些試劑盒，一切就簡(jiǎn)單多了。不用費(fèi)心地去研究各個(gè)版本的protocol，不用擔(dān)心抽提效果不好，連配試劑也省了。
土壤樣品的DNA提取
MO BIO有兩個(gè)系列的土壤dna提取試劑盒，Ultra和Power。Ultra可謂入門級(jí)，它能夠從土壤中提取PCR級(jí)的DNA，并去除樣品中的腐植酸。目前，UltraClean? 土壤DNA提取試劑盒已逐漸成為世界各地土壤微生物研究者們的優(yōu)選方法。Power則是強(qiáng)力級(jí)，包含**的抑制劑去除技術(shù)，在應(yīng)對(duì)抑制劑方面當(dāng)然更為強(qiáng)大，是處理復(fù)雜樣品的更好選擇。
純化的原理并不復(fù)雜。首先將土壤樣品加入管中，此管還含有微珠、裂解液、微珠溶液和抑制劑去除溶液。通過(guò)熱、去污劑以及機(jī)械力這三大組合，來(lái)裂解微生物。隨后，通過(guò)震蕩器的機(jī)械作用裂解細(xì)胞。裂解后，釋放出的DNA結(jié)合到硅膠膜上。洗滌之后回收DNA。整個(gè)過(guò)程非?？焖伲?0分鐘內(nèi)即可完成。
若樣品是基本土壤，那可以選擇Ultra系列。它能夠有效去除抑制劑，快速純化出高質(zhì)量的DNA，長(zhǎng)度達(dá) 50 kb以上。密歇根州立大學(xué)植物學(xué)和植物病理學(xué)系的Elise C. Poole在使用了這款試劑盒后，評(píng)價(jià)相當(dāng)高?！拔业难芯可婕暗綇V泛的土壤取樣，分析土壤中馬鈴薯瘡痂病菌的存在。我已經(jīng)使用此試劑盒來(lái)處理樣品，并對(duì)結(jié)果非常滿意，不僅DNA的量穩(wěn)定，且質(zhì)量很高，適合PCR。我會(huì)繼續(xù)使用，因?yàn)樗芸欤矣眠^(guò)的其他試劑盒都沒(méi)有這么快?！?br /> 但若是面對(duì)更有挑戰(zhàn)性的樣品，如高腐植酸含量樣品，包括堆肥、沉積質(zhì)和化肥等，那Power系列才是理想之選。這個(gè)新一代的產(chǎn)品有著**的抑制劑去除技術(shù)(IRT)，能夠從即使是困難的土壤類型中去除腐植酸和土壤中的褐色物質(zhì)，為下游成功的PCR分析助上一臂之力。后續(xù)的PCR分析適合多種生物的檢測(cè)，包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、**、藻類，放線菌類以及線蟲(chóng)類等。
據(jù)MO BIO介紹，美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局、農(nóng)業(yè)部、FBI和疾控中心均使用了這些土壤DNA試劑盒，用于生物防治、農(nóng)業(yè)和生態(tài)分析。其實(shí)，PowerSoil? 土壤DNA提取試劑盒還能用于土壤之外的其他樣品類型。MO BIO的客戶就曾成功提取了食品(奶酪、牛奶、肉類、水果)、水、昆蟲(chóng)和糞便樣品中的DNA。所以說(shuō)，名字都是浮云，實(shí)踐才是王道。
Ultra和Power系列各有三種DNA提取試劑盒，分別適用于不同的樣品量和通量。除了基本型之外，還有96孔形式的高通量試劑盒和適合大量樣品的試劑盒。
土壤DNA提取試劑盒的選擇指南：
名稱 通量 樣品量 結(jié)合能力 處理時(shí)間
PowerSoil?土壤DNA提取試劑盒 1-24 250 mg 20 μg per filter 30分鐘
PowerSoil?-htp 96孔DNA提取試劑盒 96-384 250 mg 20 μg per well 不到1天（384個(gè)樣品）
PowerMax?土壤DNA大量提取試劑盒 1-24 10 g 1 mg per filter 30分鐘
UltraClean?土壤DNA提取試劑盒 1-24 1 g 20 μg per filter 30分鐘
UltraClean?-htp 96孔土壤DNA提取試劑盒 96-384 250 mg 20 μg per well 不到1天（384個(gè)樣品）
UltraClean?大量土壤DNA提取試劑盒 1-8 20 g 1 mg per filter 50 分鐘
水樣的DNA提取
MO BIO為水樣中的DNA提取提供了三種試劑盒：Ultra、Rapid和Power。Ultra和Power的區(qū)別同樣是入門級(jí)和強(qiáng)力級(jí)之差，而Rapid則顧名思義，快，它能夠在15分鐘之內(nèi)快速提取不渾濁水樣中的DNA。
首先，通過(guò)試劑盒提供的0.22 μm或0.45 μm濾膜過(guò)濾水樣。當(dāng)然，如果你自己有濾膜的話，也可以購(gòu)買不帶濾膜的試劑盒。這種醋酸纖維素膜是安裝在一個(gè)過(guò)濾杯中的，可輕松取出，立即使用或留待后用。過(guò)濾捕獲到微生物后，將濾膜放入管中，此管中還含有微珠、微珠溶液和裂解液。通過(guò)化學(xué)和機(jī)械作用力裂解微生物，并通過(guò)震蕩器的機(jī)械作用裂解細(xì)胞。之后，釋放出的DNA與硅膠膜結(jié)合，洗滌后回收。
若是不渾濁的水樣，可選擇RapidWater? 快速水樣DNA提取試劑盒，改進(jìn)過(guò)的裂解和結(jié)合技術(shù)提高了低生物量樣品的DNA產(chǎn)量。若是渾濁且復(fù)雜的水樣，可選擇PowerWater? DNA提取試劑盒。它是新一代的從各種水樣中提取DNA的試劑盒，采用了IRT**技術(shù)，即使水樣中含有大量的污染物，也能夠成功提取出高產(chǎn)量和高質(zhì)量的 DNA。若居于兩者之間，那么UltraClean? 水樣DNA提取試劑盒更適合。它可在35分鐘內(nèi)提取水中微生物的DNA，得到的高質(zhì)量DNA(50kb以上)可應(yīng)用于PCR、限制性酶切消化以及其它應(yīng)用。
水樣DNA提取試劑盒的選擇指南：
名稱 通量 樣品量 結(jié)合能力 處理時(shí)間
PowerWater? DNA提取試劑盒 1-4 100ml-數(shù)L 20 μg per filter 20分鐘
RapidWater? 快速水樣DNA提取試劑盒 1-4 100ml-數(shù)L 20 μg per filter 14分鐘
UltraClean? 水樣DNA提取試劑盒 1-10 100ml-數(shù)L 1 mg per filter 35分鐘
生物膜的DNA提取
許多微生物粘附在胞外多聚物(EPS)上，形成了生物膜。在EPS基質(zhì)上，還發(fā)現(xiàn)了很多化合物，包括腐植酸、金屬、鹽和農(nóng)藥。因此，生物膜上的微生物很難裂解，而核酸，即使提取出來(lái)，仍含有大量抑制劑。過(guò)去也有一些從生物膜中提取核酸的方法，但通常需要數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天才能完成。
為此，MO BIO推出了PowerBiofilm? 生物膜DNA提取試劑盒。它將生物膜預(yù)處理，并改善了細(xì)胞裂解，再加上**的抑制劑去除技術(shù)，帶來(lái)了高質(zhì)量且無(wú)抑制劑的DNA。對(duì)于生物膜的核酸純化而言，困難的一步恐怕要算微生物的徹底裂解。若想高效裂解，必須降解EPS。怎么降解呢?方法不外乎幾種：化學(xué)法、機(jī)械法和酶法。 PowerBiofilm試劑盒利用這幾種方法的組合來(lái)降解EPS，讓微生物徹底暴露在裂解液中。之后使用微珠、標(biāo)準(zhǔn)裂解液和裂解增強(qiáng)液，確保微生物群落的佳裂解。
不過(guò)，裂解是裂解了，還不能高興地太早，降解的EPS及其他化合物仍會(huì)殘留，抑制核酸的下游應(yīng)用。為了防止這一點(diǎn)，PowerBiofilm試劑盒使用**的IRT技術(shù)去除腐植物質(zhì)、多糖和多酚。通過(guò)這幾步組合拳，生物膜中的DNA總算是順利提取出來(lái)，且拋開(kāi)了惱人的抑制劑。

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