GTP酶研究新工具（一）

GTP酶是一個水解酶的大家族，它們能夠結(jié)合并水解三磷酸尿苷(GTP)。GTP結(jié)合與水解是在所有GTP酶共有的高度保守G結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的。GTP酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白生物合成、蛋白轉(zhuǎn)位以及囊泡運(yùn)輸上都扮演了重要角色。

異三聚體GTP酶通常與g蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合，有著不同的信號異構(gòu)體，來確定受體信號。小GTP酶超家族包含數(shù)百個蛋白，它們可進(jìn)一步細(xì)分成Ras、Rho/Rac、Rab、 Arf和Ran家族。這些單體GTP酶在細(xì)胞內(nèi)信號事件中起著分子開關(guān)的作用，這要取決于它們是與GTP結(jié)合，還是與GDP結(jié)合。

為了研究GTP酶的活性，賽默飛世爾科技公司推出了一系列產(chǎn)品。Thermo Scientific Pierce GTP酶富集試劑盒(Thermo Scientific Pierce GTPase Enrichment Kit)。顧名思義，它可選擇性標(biāo)記并富集小GTP酶和G蛋白大亞基。試劑盒提供的試劑廣泛適用于組織、細(xì)胞以及亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組中GTP結(jié)合蛋白的富集。

Pierce GTP酶富集試劑盒由新型的脫硫生物素-核苷酸探針技術(shù)拓展而來，該技術(shù)也應(yīng)用于Thermo Scientific新近推出的激酶富集試劑盒。核苷酸與脫硫生物素相結(jié)合，后者是由ActivX Biosciences開發(fā)的生物素的類似物。核苷酸與GTP結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)結(jié)合，利用脫硫生物素標(biāo)簽，即可進(jìn)行針對其結(jié)合的蛋白進(jìn)行捕獲和富集。與生物素和蛋白的結(jié)合相比較，脫硫生物素結(jié)合的力量較弱，當(dāng)使用生物素替換、低pH或加熱時，脫硫生物素與被捕獲的蛋白能夠輕松分離。

若想研究抑制劑結(jié)合親和力和目標(biāo)特異性，可將樣品與小分子抑制劑預(yù)先孵育?；钚晕稽c(diǎn)的標(biāo)記可通過 Western blot或質(zhì)譜來分析(下圖)。對于Western blot流程，脫硫生物素標(biāo)記的蛋白富集后，可開展SDS-PAGE分析，進(jìn)而檢測。對于質(zhì)譜流程，脫硫生物素標(biāo)記的蛋白被還原、烷基化并消化成肽段。兩個流程都可確定抑制劑目標(biāo)的結(jié)合，但只有質(zhì)譜流程能夠鑒定出整體的抑制劑目標(biāo)和脫靶。

通過質(zhì)譜流程，研發(fā)人員鑒定出超過500種活性位點(diǎn)肽段，對應(yīng)了G蛋白大亞基和小GTP酶家族的66種不同的GTP酶(下表)。通過這種方法生成的蛋白質(zhì)組目標(biāo)列表可實(shí)現(xiàn)多個細(xì)胞和組織類型中GTP酶表達(dá)的比較。

Pierce GTP酶富集試劑盒包括所有的標(biāo)記和富集所需的試劑，包括ActivX GTP探針，足夠16次富集使用。探針也可單獨(dú)購買。