第三代測序技術的三種技術平臺介紹

隨著生物學的發(fā)展，人們對基因的功能研究更加透徹，為了進一步研究和改造基因的目的需要詳細了解生物的基因組全序列，因為DNA序列是改造基因的基礎，這就要求具有高效的dna測序技術。DNA測序技術到目前為止已經發(fā)展到了第三代測序技術。

早的Sanger測序在人類基因組計劃中立下赫赫戰(zhàn)功，但也給基因組測序貼上了數億美元的價格標簽，讓人生畏。這兩年發(fā)展迅猛的**代測序儀——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系統(tǒng)——讓人類基因組重測序的費用蹭地降低到10萬美元以下。現在，能對單個DNA分子進行測序的第三代測序儀也加入到這場比賽中，讓競爭更加激烈。

目前，第三代測序主要有三種技術平臺。兩種通過摻入并檢測熒光標記的核苷酸，來實現單分子測序。Helicos的遺傳分析系統(tǒng)已上市，而Pacific Biosciences準備在明年推出單分子實時(SMRT)技術。第三種Oxford Nanopore的納米孔(nanopore)測序還尚未有推出的時間表，但有可能是這三種當中便宜的。納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對DNA進行標記，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCD照相機。

近，Oxford Nanopore Technologies的Hagan Bayley及他的研究小組正致力于改善納米孔。根據他們之前的工作，他們以a-溶血素來設計納米孔，并將環(huán)式糊精共價結合在孔的內側(下圖)。當核酸外切酶消化單鏈DNA后，單個堿基落入孔中，它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用，并阻礙了穿過孔中的電流。每個堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振幅，因此很容易轉化成DNA序列。每個堿基也有特有的平均停留時間，它的解離速率常數是電壓依賴的，+180 mV的電位能確保堿基從孔的另一側離開。

a-溶血素納米孔(剖面圖)以及共價結合的環(huán)式糊精(淺藍色)瞬間結合落入孔中的堿基(紅色)。

以往對甲基胞嘧啶進行測序，都要先進行重亞硫酸鹽轉化，而納米孔技術能直接讀出這第五種堿基。這對表觀基因組測序的研究人員來說可謂是個好消息。

納米孔測序預計能滿足大部分測序用戶的需求：99.8%的準確性相當高，且錯誤很容易通過計算來糾正。均聚物延伸也沒有問題，因為納米孔記錄每一個堿基，而不管其前后的堿基。讀長也會很長。Bayley認為：“它有可能讀取數千個堿基，序列質量也不會下降。即使中途有一些小差錯，它也可以重新開始。”

但是，Oxford Nanopore的測序儀仍面臨兩個重要的技術問題。一是如何將核酸外切酶更好地附著在孔上，讓它每次只掉入一個堿基，這是一個大挑戰(zhàn)。另一個是并行化。這個問題可能簡單一些。他們可以開發(fā)出一個芯片，上面有數萬個孔，來確保整個測序過程更快速。

在納米孔測序技術的推動下，實現千元基因組的目標指日可待了。

基因測序技術始于上個世界70年代，到目前為止已經發(fā)展到了第三代測序技術。第三代納米孔測序技術因為其不再需要熒光標記物使測序價格大大降低，這項技術預示著基因測序技術又登上了一個新的臺階。