目前，國(guó)外許多制藥企業(yè)對(duì)高內(nèi)涵篩選表現(xiàn)出濃厚的興趣，全球有數(shù)百家新藥研究機(jī)構(gòu)啟動(dòng)了這一領(lǐng)域的研究項(xiàng)目。國(guó)外業(yè)界人士認(rèn)為，高內(nèi)涵篩選不僅能闡明被篩樣品與藥靶的相互作用關(guān)系，而且可同時(shí)了解細(xì)胞的其他生物學(xué)改變，進(jìn)而研究其對(duì)相關(guān)代謝途徑的影響，并通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)來(lái)預(yù)測(cè)化合物的毒性。在這樣的要求和技術(shù)的發(fā)展下，要怎樣進(jìn)行高內(nèi)涵細(xì)胞水平的篩選成了關(guān)鍵性的問(wèn)題。
什么是高內(nèi)涵細(xì)胞篩選
所謂高內(nèi)涵篩選(high content screening，HCS; 或high content analysis，HCA)是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時(shí)檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，確定其生物活性和潛在毒性。在活細(xì)胞自然條件下研究蛋白質(zhì)功能可以比較準(zhǔn)確地了解其生物學(xué)特性(如在細(xì)胞內(nèi)的分布轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等)，而新近發(fā)展的光學(xué)顯微技術(shù)(尤其是顯微熒光定量方法)和與之配套的計(jì)算機(jī)圖像處理及數(shù)據(jù)分析軟件已成為這類研究的基本手段。高內(nèi)涵篩選分析正是基于上述科學(xué)技術(shù)進(jìn)步而產(chǎn)生的一種全新的新藥研究手段。與分子水平篩選相比，細(xì)胞水平的篩選免去了對(duì)靶標(biāo)蛋白的純化，使靶標(biāo)蛋白的構(gòu)象及所處的環(huán)境更接近天然的生理狀態(tài)，同時(shí)那些具有細(xì)胞毒性和/或不能透過(guò)細(xì)胞膜的化合物將被排除。
高內(nèi)涵篩選的原理
高內(nèi)涵篩選的儀器一般由白色連續(xù)光源、多通道濾光片(適于常用的熒光染料)、顯微鏡模塊和高速高分辨率的CCD照相機(jī)進(jìn)行圖像的獲取，同時(shí)還可以配備細(xì)胞培養(yǎng)和自動(dòng)加樣模塊進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間全自動(dòng)的實(shí)驗(yàn)分析?；诩す獾挠布劢瓜到y(tǒng)使得自動(dòng)對(duì)焦在200ms之內(nèi)，再結(jié)合軟件聚焦，完善了對(duì)拍攝對(duì)象的快速定位和圖像獲取。除了圖像獲取部分外，圖像采集、圖像分析和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存也是高內(nèi)涵**篩選設(shè)備的主要組成部分。其中用于圖像分析的應(yīng)用軟件大致可以分為兩種：一種是針對(duì)某類特定生物學(xué)反應(yīng)而設(shè)計(jì)的專用分析模塊，研究人員能夠在一定程度上通過(guò)修改參數(shù)來(lái)適應(yīng)檢測(cè)精度的需要，另一種為使用者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)要求自己來(lái)設(shè)計(jì)軟件(客戶自定義軟件),如GE 公司的Developer Toolbox, 是目前全球**一個(gè)可以允許用戶根據(jù)自己細(xì)胞系的特點(diǎn)自行創(chuàng)建分析方法，并對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行更深層次的區(qū)域劃分和定義，獲得真正量身定做的分析結(jié)果的軟件，并在2006 年獲得美國(guó)《Scientific Computing》雜志授予的“年度佳生物圖像分析軟件獎(jiǎng)”。 實(shí)施高內(nèi)涵分析在單位時(shí)間里會(huì)產(chǎn)生和采集數(shù)以萬(wàn)計(jì)的圖像，必須及時(shí)處理和妥善保存。一個(gè)完整的高內(nèi)涵篩選技術(shù)系統(tǒng)應(yīng)該包括具有一定開放性的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫(kù)，對(duì)不同來(lái)源的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一的分析和管理，同時(shí)允許研究人員調(diào)取信息，分析研究。
運(yùn)用高內(nèi)涵技術(shù)進(jìn)行**篩選和毒性評(píng)估
目前高內(nèi)涵篩選技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從功能鑒定逐漸拓展到靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、靶點(diǎn)驗(yàn)證、活性初篩、代謝及毒理等研究領(lǐng)域，顯示了巨大的發(fā)展?jié)摿?。主要的檢測(cè)范圍包括：靶點(diǎn)激活、細(xì)胞凋亡、分裂指數(shù)、蛋白轉(zhuǎn)位、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移、受體內(nèi)化、核質(zhì)或者質(zhì)膜轉(zhuǎn)位、細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，細(xì)分下來(lái)可以檢測(cè)上百種細(xì)胞參數(shù)指標(biāo)，其應(yīng)用幾乎涵蓋細(xì)胞分析的所有方面。下面通過(guò)實(shí)例來(lái)說(shuō)明高內(nèi)涵篩選技術(shù)在新藥開發(fā)和**毒性評(píng)估中的強(qiáng)大應(yīng)用。
建立針對(duì)高爾基復(fù)合體的藥篩模型
高爾基復(fù)合體作為細(xì)胞內(nèi)的分泌途徑參與到了相應(yīng)外界刺激中，并且可能根據(jù)刺激信號(hào)的不同程度來(lái)激活修復(fù)或者相反的凋亡機(jī)制，目前已經(jīng)被認(rèn)為是可能的癌癥研究和**的**靶點(diǎn)。目前已經(jīng)有一些化合物被證明能夠引起高爾基復(fù)合體的形態(tài)變化，因此開發(fā)一種能夠展示高爾基復(fù)合體在不同環(huán)境下的多參數(shù)形態(tài)和組分變化的方法，將對(duì)針對(duì)其的**開發(fā)提供巨大的幫助。運(yùn)用高內(nèi)涵分析結(jié)合多種高爾基組分特異熒光標(biāo)記能夠快速得到極高分辨率的展示高爾基特性的圖片。
在下圖的方法中，特異compartment標(biāo)記用來(lái)區(qū)分cis-Golgi和trans-Golgi network (TGN)，并且利用軟件獲得定量的定位(比如分布和數(shù)目)和形態(tài)(比如大小)等結(jié)果從而檢測(cè)化合物的活性。在這種方法里，圖像的質(zhì)量和精度必須達(dá)到一定的程度才能細(xì)致的區(qū)分不同結(jié)構(gòu)。除了使用高NA值的高倍鏡頭外，利用軟件進(jìn)行圖像復(fù)原也可以達(dá)到提高細(xì)節(jié)分辨率的效果。下圖中使用了2D去卷積模式，大大提高了圖像尤其是標(biāo)記物的邊界的對(duì)比度和精度，從而保證正確的劃分和分析。利用高質(zhì)量和高通量的圖像分析高爾基復(fù)合體在不同化合物作用下的結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞活性從而使得用于篩選促進(jìn)和拮抗**的高通量藥篩模型得以實(shí)現(xiàn)。。
Nocodazole處理后的cis-Golgi和trans-Golgi network (TGN)的共定位分析
圖片使用GE Healthcare的IN CELL 2000高內(nèi)涵成像儀在40×/0.6 NA 物鏡下使用2D去卷積模式拍攝。HeLa細(xì)胞使用1.85 μM nocodazole處理4小時(shí)后染色拍攝。細(xì)胞核(藍(lán)色);cis-Golgi(綠色);TGN(紅色);共定位信號(hào)為黃色。
細(xì)胞毒性分析
**研發(fā)過(guò)程中，如果在晚期才發(fā)現(xiàn)**的毒副作用會(huì)顯著增加項(xiàng)目成本，推遲上市時(shí)間，甚至上市后才發(fā)現(xiàn)比如心臟毒性造成健康威脅將會(huì)面臨撤市，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)危害。當(dāng)前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)高通量化的細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)主要分為兩類：a)基于線粒體活性的方法，如MTT法、Alamar Blue法和ATP生物發(fā)光法等;b)基于細(xì)胞膜通透性的熒光染色法，如Propidium iodide等。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡通路的不斷認(rèn)識(shí)，通過(guò)不同熒光標(biāo)記技術(shù)判斷和區(qū)分細(xì)胞死亡和凋亡與壞死細(xì)胞毒性檢測(cè)方法已越來(lái)越普遍。
雖然熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀配合上述適當(dāng)?shù)臒晒馊玖鲜菂^(qū)分凋亡或壞死常用的手段。高內(nèi)涵篩選方法使實(shí)現(xiàn)熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡高通量化成為可能。高內(nèi)涵分析是全自動(dòng)活細(xì)胞分析系統(tǒng), 其全自動(dòng)位移,全自動(dòng)聚焦, 高速圖像獲取和全自動(dòng)軟件圖像分析是共聚焦顯微鏡無(wú)法比擬的，尤其是利用應(yīng)用軟件, 可以通過(guò)對(duì)不同檢測(cè)指標(biāo)展開組合來(lái)分析細(xì)胞毒性。2011年GE healthcare又推出了基于共聚焦系統(tǒng)的高內(nèi)涵分析系統(tǒng)IN CELL 6000搭載獨(dú)有的可變的共聚焦光闌，大大提高了圖像質(zhì)量。流式細(xì)胞儀是對(duì)DNA 進(jìn)行熒光探針標(biāo)記，在高速細(xì)胞液流從噴嘴噴出時(shí)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞相關(guān)參數(shù)，并不需要成像。高內(nèi)涵分析系統(tǒng)采用的是96 或384 孔板多樣品平行數(shù)據(jù)采集和分析，在樣品多時(shí)有著明顯優(yōu)勢(shì)，分析時(shí)間要比需要單個(gè)樣品逐個(gè)處理的流式細(xì)胞儀快數(shù)百倍。同時(shí)基于圖像的分析可以對(duì)終結(jié)果進(jìn)行原始圖像的追述，大大提高結(jié)果的可靠性。
上述高內(nèi)涵實(shí)驗(yàn)技術(shù)經(jīng)過(guò)短短數(shù)年的發(fā)展已經(jīng)逐步整合到高通量**篩選的實(shí)踐中，并且在儀器制造、圖像處理和運(yùn)轉(zhuǎn)速效等方面都有了進(jìn)一步的提高。標(biāo)記分子、常用試劑的開發(fā)也逐漸超越GFP和現(xiàn)有的熒光染料，以便開展更多的活細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)。高內(nèi)涵篩選分析軟件更是在數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判定方面舉足輕重, 在**篩選中起到越來(lái)越大的作用。細(xì)胞水平高內(nèi)涵**篩選和**毒性篩選越來(lái)越成為新藥創(chuàng)制過(guò)程中不可或缺的技術(shù)選擇。（生物幫bio1000.com）
