摘要： IN Cell Analyzer 2000是一種全新的高性能成像系統(tǒng)，靈活地設(shè)計(jì)足以應(yīng)對(duì)多種需求——從全自動(dòng)顯微鏡到自動(dòng)化的高內(nèi)涵篩選。在此展示了IN Cell Analyzer 2000在斑馬魚(yú)(**開(kāi)發(fā)和毒性研究的模式生物)分析應(yīng)用中的全控成像能力。
作者：1 Ahmad Yekta*, 1 Zahra Masoumi, 2 Albie Santos & 1 Daniel Manning
1美國(guó)新澤西州通用電氣醫(yī)療集團(tuán);2英國(guó)英格蘭白金漢郡安瑪西亞鎮(zhèn)通用電氣醫(yī)療集團(tuán)
e-mail: Ahmad.Yekta@ge.com
簡(jiǎn)介
斑馬魚(yú)和線蟲(chóng)作為**開(kāi)發(fā)和毒性研究的模式生物，在成像和分析上的興趣日益增長(zhǎng)。成體斑馬魚(yú)在長(zhǎng)度上會(huì)生長(zhǎng)至約4 cm，然而許多有用的研究都是針對(duì)其受精后5天(5-dpf)的近乎透明的幼蟲(chóng)而開(kāi)發(fā)，而幼蟲(chóng)的大小約為< 4 mm。為此，96孔形式的微滴定板是適合的試驗(yàn)板，因其孔有著足夠的碳酸水容量，能維持斑馬魚(yú)的生存。此外，每孔中只放入1條魚(yú)是比較理想的，這樣它的健康狀況就不會(huì)影響到鄰居的生存。
這些需求減慢了大部分顯微鏡和高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的通量，因?yàn)榧词乖?倍放大率下，還是需要對(duì)多個(gè)視場(chǎng)進(jìn)行成像，以確保全孔都被覆蓋。在此我們展示了全新的IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)的特征如何克服這些困難：(1) 大芯片照相機(jī)能夠在2倍物鏡下進(jìn)行快速的單圖像全孔成像，而圖像陰影小;(2) 對(duì)于更高放大率的成像，用戶控制的命令能移動(dòng)/改變目的區(qū)域的物鏡，而無(wú)縫的圖像拼接能得到高分辨率的全孔圖像;(3) 兩種獨(dú)立的自動(dòng)對(duì)焦模式能實(shí)現(xiàn)精確的z-疊加，因此任意兩個(gè)器官的垂直距離都能夠確定。
方法
樣品制備：
斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)樣品是由Phylonix Inc.饋贈(zèng)的。受精后5天的野生型斑馬魚(yú)先在三卡因中麻痹，再用4%多聚甲醛固定。幼蟲(chóng)放置在#3599 Corning Costar 96孔板的150 μl固定培養(yǎng)基中。
圖像獲取：
圖像是用IN Cell Analyzer 2000獲取的。物鏡為：2×/0.1 NA、4×/0.1 NA、10×/0.45 NA，利用透射光和熒光模式及適當(dāng)?shù)臑V光片和曝光時(shí)間。大CCD照相機(jī)((Photometrics CoolSnap K4)，加上2倍物鏡，能獲得7.6×7.6 mm2 的視場(chǎng)，在單次圖像捕獲中覆蓋96孔板的全孔(直徑6.4 mm)。
為了捕獲z維的整個(gè)斑馬魚(yú)，我們獲得了Z-疊加物(圖4)，每次疊加100張圖片，間隔10 μm(表2)，總距離為1000 μm。
圖像拼接與分析：
對(duì)于更高分辨率的全孔成像，在5%重疊時(shí)使用了儀器的自動(dòng)圖像重疊特征。這樣就能對(duì)全孔或目的區(qū)域進(jìn)行成像。之后，圖像文件轉(zhuǎn)移到IN Cell Investigator 1.5，在那里進(jìn)行自動(dòng)的圖像拼接，產(chǎn)生1幅每個(gè)孔的圖像。
幼蟲(chóng)在孔底部的放置、排列及姿勢(shì)
在研究的樣品中，麻痹或固定的受精后5天斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)沉在孔底部。體軸相對(duì)于板側(cè)面的排列是隨機(jī)的，但有一個(gè)附著傾向，就是斑馬魚(yú)頭部對(duì)著孔壁。姿勢(shì)多半是側(cè)面的，這樣只能對(duì)1個(gè)眼睛進(jìn)行成像(圖2)。約有10%的幼蟲(chóng)呈現(xiàn)頭部部分偏向腹部的姿勢(shì)，在圖像中就能看見(jiàn)1?到2個(gè)眼睛(圖4)。
IN Cell Analyzer 2000的視場(chǎng)(FOV)大小
系統(tǒng)的大CCD芯片照相機(jī)有著正方形的視場(chǎng)，每一側(cè)為2048像素。視場(chǎng)的尺寸取決于物鏡的選擇，如表1所示。
斑馬魚(yú)的單拍全孔成像的需要
在自動(dòng)成像中，通量的需求要求目的樣品放置在單個(gè)視場(chǎng)內(nèi)并成像。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)的佳放置形式是96孔板，因?yàn)樗凶銐蛄康奶妓崴?~ 150 μl)以維持魚(yú)的生存。每條魚(yú)應(yīng)放置在單個(gè)孔中，以避免交叉污染的作用。
既然幼蟲(chóng)在孔中的位置是相當(dāng)隨機(jī)的，那么就需要對(duì)全孔成像，以免錯(cuò)過(guò)樣本。圖1顯示了在2倍物鏡和7.6×7.6 mm2 的視場(chǎng)下，IN Cell Analyzer 2000的大CCD照相機(jī)很容易在單次拍攝中覆蓋每個(gè)孔的全部區(qū)域(孔直徑為6.4 mm)。這樣，每天就能對(duì)幾千條斑馬魚(yú)進(jìn)行自動(dòng)成像。
圖1. IN Cell Analyzer 2000自動(dòng)獲取的受精后5天斑馬魚(yú)圖像的縮略圖。2倍物鏡、Corning Costar #3599 96孔板、每孔150 μl水。上面3行，透射光;下面3行，F(xiàn)ITC熒光通道。
圖2顯示了斑馬魚(yú)透射光圖像的放大瀏覽。2倍放大率的單圖像捕獲滿足了許多需要在器官水平測(cè)量的分析應(yīng)用的需求。這是因?yàn)?倍放大率下系統(tǒng)的分辨率(圖像像素大小)約為3.7 μm/像素，而即使小的器官如心臟約為100倍大，為準(zhǔn)確的形態(tài)測(cè)定和密度測(cè)量提供了足夠的分辨率。
圖2. 受精后5天未染色的斑馬魚(yú)在IN Cell Analyzer 2000上的全孔透射光圖像。2倍物鏡、自動(dòng)對(duì)焦、96孔板(Corning Costar #3599)、150 μl水。正方形的圖像視場(chǎng)，7.6 mm;圓孔直徑，6.4 mm。盡管在大視場(chǎng)下孔中心到邊緣的密度不均勻性很小，但如果需要，也可通過(guò)平場(chǎng)校正來(lái)輕松調(diào)整。在圖像獲取過(guò)程中，大小參照條也包含在內(nèi)。
圖3. IN Cell Analyzer 2000在透射光模式下對(duì)受精后5天未染色的斑馬魚(yú)的尾部區(qū)域進(jìn)行成像。10倍物鏡、自動(dòng)對(duì)焦、96孔板的說(shuō)明見(jiàn)圖1。盡管幼蟲(chóng)是近乎透明的，但鰭、脊索、泌尿生殖器開(kāi)口和色素細(xì)胞清晰可見(jiàn)。大小參照條是自動(dòng)捕獲的。
IN Cell Analyzer 2000系統(tǒng)采用兩種方法來(lái)獲取更高分辨率的圖像，以觀察斑馬魚(yú)細(xì)胞水平的體內(nèi)細(xì)節(jié)。舉個(gè)例子，你可能想通過(guò)熒光染色細(xì)胞的測(cè)量來(lái)檢測(cè)神經(jīng)毒性作用[2]。**種方法，你可以在2倍物鏡下對(duì)每個(gè)孔的幼蟲(chóng)進(jìn)行快速全孔成像，然后通過(guò)電腦控制將物鏡轉(zhuǎn)變成10倍(或20倍)，再將XY鏡臺(tái)移動(dòng)并定位到感興趣的器官區(qū)域(如圖3所示)。
**種方法在需要高分辨率的全孔覆蓋時(shí)特別有用(如每孔多個(gè)生物體)，你可以選擇系統(tǒng)的場(chǎng)重疊特征(如5%重疊)，并獲取適當(dāng)數(shù)量的圖像。例如，在10倍物鏡下，你需要獲取25個(gè)視場(chǎng)來(lái)覆蓋全孔(表1)。接下來(lái)，這組圖像傳輸?shù)絀N Cell Investigator 1.5 應(yīng)用中，來(lái)進(jìn)行無(wú)縫的圖像拼接和分析。
斑馬魚(yú)的自動(dòng)Z疊加成像
樣本的軸向厚度取決于成像時(shí)的軀體面積，可在0.2至1 mm之間變動(dòng)。IN Cell Analyzer 2000的Z疊加成像特征可用于從幼蟲(chóng)中提取三維的信息。
對(duì)于常規(guī)的成像(無(wú)需Z切片)，你需要考慮厚樣本所發(fā)生的圖像模糊的影響。尾部區(qū)域更薄更透明，因此它的高分辨率圖像看起來(lái)相對(duì)銳利，如圖3所示。頭部及中間軀干的區(qū)域更厚，在選擇的物鏡下可能會(huì)模糊(圖4)。這是因?yàn)橹挥挟?dāng)樣本部分處于物鏡的景深(DOF)之內(nèi)時(shí)，圖像才能對(duì)焦準(zhǔn)確。
表2 A/B顯示了系統(tǒng)支持物鏡的景深計(jì)算值列表(對(duì)于大照相機(jī)和470 nm的透射光模式藍(lán)色LED)。
例如，在圖4中，10倍物鏡的景深是2.7 μm，而位于景深之外的樣本部分就會(huì)顯得模糊。盡管如此，你可以讀出焦平面的Z值，并計(jì)算出兩眼之間的近似距離為250 μm×1.4 ≈ 350 μm。系數(shù)1.4是幼蟲(chóng)頭部材料折射率的假定平均值。在今后的研究中，我們將研究系統(tǒng)的自動(dòng)3D去卷積模塊的應(yīng)用，以改善高分辨率斑馬魚(yú)圖像中的切片和去模糊。
圖4. 利用透射光對(duì)斑馬魚(yú)頭部所拍攝的三張Z疊加圖像。10倍物鏡、96孔板的說(shuō)明見(jiàn)圖1。特意選擇頭部輕微翹起的幼蟲(chóng)，這樣就能看見(jiàn)上部和下部眼睛區(qū)域的切片。綠色的虛線圖能協(xié)助區(qū)分眼睛的邊界。
小結(jié)
?IN Cell Analyzer 2000能用于熒光和透射光模式下，對(duì)板中斑馬魚(yú)進(jìn)行自動(dòng)成像。
?系統(tǒng)的大CCD照相機(jī)在2倍物鏡下能捕獲7.6×7.6 mm2 的視場(chǎng)。這能夠?qū)?6孔板進(jìn)行快速的單圖像全孔成像。
?2倍物鏡有著約3.4 μm的橫向分辨率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)從小斑馬魚(yú)器官中捕獲細(xì)節(jié)的需要，比如其心臟大小約為300 μm。
?更高分辨率的全孔成像可由系統(tǒng)的視場(chǎng)重疊功能+IN Cell Investigator 1.5的自動(dòng)圖像拼接來(lái)實(shí)現(xiàn)。
?斑馬魚(yú)的三維特征可通過(guò)自動(dòng)Z疊加來(lái)研究。
結(jié)論
?IN Cell Analyzer 2000能夠?qū)Π唏R魚(yú)模式生物進(jìn)行全自動(dòng)且連續(xù)的高內(nèi)涵成像。
新一代高內(nèi)涵分析細(xì)胞成像系統(tǒng) ─ IN Cell Analyzer 2000在4月底法國(guó)里爾的生物分子科學(xué)學(xué)會(huì) (SBS)第15屆年會(huì)上首度亮相?，F(xiàn)場(chǎng)的系統(tǒng)演示贏得了眾多參訪者的肯定及熱烈回響。該系統(tǒng)的靈活性讓研究人員用單個(gè)儀器就能完成過(guò)去具挑戰(zhàn)性的實(shí)驗(yàn)：從顯微觀察到自動(dòng)化篩選，以及細(xì)胞器、細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體的成像。
IN Cell Analyzer 2000有著硬件和軟件的獨(dú)特組合，能夠非?？焖俚孬@取圖像，是篩選的理想選擇。該儀器是利用六西格瑪原理來(lái)設(shè)計(jì)的，結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，能確保它在多用戶環(huán)境中高通量應(yīng)用的可靠性。
沿襲 IN Cell Analyzer 1000高質(zhì)量成象，功能完整性及模塊化設(shè)計(jì), IN Cell Analyzer 2000新增一些新特征包括：
● 全新硬件設(shè)計(jì): 更穩(wěn)定,易操作和一體化主機(jī), 將CO2, 溫控, 液體操控和電源/穩(wěn)壓全部集為一體
● 更快的聚焦和成像掃描速度: 比IN Cell Analyzer 1000提高約一倍
● 增加予掃描功能: 在獲取圖像之前對(duì)樣品的選定區(qū)域進(jìn)行快速的預(yù)覽掃描, 使用者可以快速找尋到關(guān)鍵位點(diǎn)并獲取圖像,大幅提升對(duì)于干細(xì)胞、神經(jīng)突生長(zhǎng)等非融合性細(xì)胞觀測(cè)的準(zhǔn)確度及效能
● 高性能大視野CCD和全孔成像：照相機(jī)加上寬視野光源，確保一次完成整孔的成像而無(wú)需多次成像后的拼接,在單張圖像中捕獲整個(gè)細(xì)胞孔的信息，提高成像能力
● 更寬范圍高NA值物鏡選擇(2×, 4×, 10×, 20×, 40×, 60×, 100×): 滿足多種靈敏度和放大倍數(shù)的要求
● 全自動(dòng)物鏡, 分光器和濾光片切換選擇
● 更高圖像分辨率和質(zhì)量: 提供多種圖像分析處理方式 (2D, 2.5D, 3D deconvolution?)
● 三種透視光(白光)成像功能: 亮視野, DIC, 像差
